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技術(shù)文章
細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒的使用方法
點擊次數(shù)：3484 發(fā)布時間：2013-1-23
使用說明：
1.準(zhǔn)備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細胞漿蛋白抽
提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細胞核蛋白抽提試
劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2.對于貼壁細胞：用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，
并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用*
消化細胞，以免*降解需抽提的目的蛋白。
3.對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
4.每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。（對于二百萬Hela細胞，其細胞
沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）
5.zui高速劇烈Vortex5秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可
以適當(dāng)延長vortex時間。）
6.冰浴10-15分鐘。
7.加入細胞漿蛋白抽提試劑B10微升。zui高速劇烈Vortex5秒，冰浴1分鐘。
8.zui高速劇烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g離心5分鐘。
9.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。（千
萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）
10.對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會
帶來細胞漿蛋白的污染。）
11.zui高速劇烈Vortex15-30秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速
劇烈Vortex15-30秒，共30分鐘。
12.4℃12,000-16,000g離心10分鐘。
13.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃凍
存。
14.對于新鮮組織：
A.把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B（例
如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成
組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃
勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。
B.勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
C.4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細胞漿蛋白。（吸上
清時千萬不要觸及沉淀。）
D.對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開
始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細胞漿蛋
白和細胞核蛋白。抽提得到的細胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細胞漿蛋白合并。
1.準(zhǔn)備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細胞漿蛋白抽
提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細胞核蛋白抽提試
劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2.對于貼壁細胞：用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，
并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用*
消化細胞，以免*降解需抽提的目的蛋白。
3.對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
4.每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。（對于二百萬Hela細胞，其細胞
沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）
5.zui高速劇烈Vortex5秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可
以適當(dāng)延長vortex時間。）
6.冰浴10-15分鐘。
7.加入細胞漿蛋白抽提試劑B10微升。zui高速劇烈Vortex5秒，冰浴1分鐘。
8.zui高速劇烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g離心5分鐘。
9.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。（千
萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）
10.對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會
帶來細胞漿蛋白的污染。）
11.zui高速劇烈Vortex15-30秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速
劇烈Vortex15-30秒，共30分鐘。
12.4℃12,000-16,000g離心10分鐘。
13.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃凍
存。
14.對于新鮮組織：
A.把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B（例
如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成
組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃
勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。
B.勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
C.4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細胞漿蛋白。（吸上
清時千萬不要觸及沉淀。）
D.對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開
始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細胞漿蛋
白和細胞核蛋白。抽提得到的細胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細胞漿蛋白合并。